فهرست مطالب
رنگ آمیزی گرم نخستین آزمون در شناسایی باکتری است و در چند دقیقه نشان می‌دهد باکتری گرم مثبت است یا گرم منفی و شکل سلول‌ها چگونه است. سه رنگ‌آمیزی دیگر، یعنی اسپور، کپسول و تاژک، ویژگی‌های ساختاری مهم باکتری را نمایان می‌کنند.
مطالب این راهنما بر اساس مجموعهٔ آموزشی «رنگ‌آمیزی میکروب» ارائه‌شده توسط دکتر جعفری در دانش ثمین پردیس رضوان تنظیم شده است.
آماده‌سازی گسترش (اسمیر)
- یک قطره آب مقطر روی لام تمیز بگذارید.
- با لوپ استریل مقدار کمی از کلنی را برداشته و به‌آرامی پخش کنید.
- بگذارید هوا خشک شود.
- با عبور سریع از شعله، لام را فیکس کنید.
1) رنگ آمیزی گرم
دیوارهٔ سلولی گرم مثبت‌ها لایهٔ ضخیم پپتیدوگلیکان دارد و رنگ بنفش را نگه می‌دارد. گرم منفی‌ها با الکل بی‌رنگ و با سافرانین صورتی می‌شوند.
- کریستال ویوله، ۱ دقیقه؛ آب‌کشی
- لوگل (ید)، ۱ دقیقه؛ آب‌کشی
- رنگ‌بر الکل یا الکل-استون، چند ثانیه (حساس‌ترین مرحله)
- سافرانین، ۳۰ تا ۶۰ ثانیه؛ آب‌کشی و خشک‌کردن
- مشاهده با عدسی روغنی ۱۰۰×
تفسیر: بنفش یعنی گرم مثبت و صورتی-قرمز یعنی گرم منفی. ویبریوها و بسیاری از باکتری‌های بیماری‌زای آبزیان گرم منفی‌اند.
2) رنگ آمیزی اسپور
اسپور باکتری‌ها (مثلاً باسیلوس‌ها) دیوارهٔ ضخیم دارد و رنگ را سخت می‌گیرد. در روش شفر-فولتون، رنگ مالاشیت گرین با حرارت وارد اسپور می‌شود، سپس سلول رویشی با سافرانین رنگ می‌گیرد. نتیجه: اسپور سبز، سلول رویشی قرمز.
3) رنگ آمیزی کپسول
کپسول لایه‌ای پلی‌ساکاریدی اطراف سلول است و رنگ را جذب نمی‌کند. با رنگ‌آمیزی منفی (مثلاً جوهر هندی یا نیگروزین) زمینه تیره و کپسول به‌صورت هالهٔ روشن اطراف سلول دیده می‌شود. در این روش نباید لام را با حرارت فیکس کرد.
4) رنگ آمیزی تاژک
تاژک‌ها بسیار نازک‌اند و با میکروسکوپ نوری معمولی دیده نمی‌شوند. با روش‌های ویژه (مانند لیفسون) ماده‌ای روی تاژک می‌نشیند تا ضخامتش زیاد شود. این آزمون دقیق‌ترین و حساس‌ترین رنگ‌آمیزی است و نیاز به لام کاملاً تمیز و کشت جوان دارد.
جمع‌بندی و خطاهای رایج
| رنگ‌آمیزی | هدف | نتیجه |
|---|---|---|
| گرم | تفکیک گرم مثبت/منفی | بنفش یا صورتی |
| اسپور | وجود اسپور | اسپور سبز |
| کپسول | وجود کپسول | هالهٔ روشن |
| تاژک | تعداد و محل تاژک | رشته‌های نازک رنگی |
- کشت قدیمی (بیش از ۲۴ ساعت) نتیجهٔ گرم را مختل می‌کند
- رنگ‌بری بیش از حد، گرم مثبت را گرم منفی نشان می‌دهد
- گسترش ضخیم باعث رنگ‌بری ناقص می‌شود
- استفاده از رنگ‌های کهنه یا رسوب‌دار
نکات عملی مشاهدهٔ میکروسکوپی
لام را ابتدا با عدسی ۱۰× و ۴۰× پیدا کنید و سپس با یک قطره روغن ایمرسیون روی عدسی ۱۰۰× ببینید. پس از کار، عدسی را با کاغذ مخصوص عدسی و در صورت نیاز با پاک‌کنندهٔ مناسب تمیز کنید.
اگر در یک گسترش، هم سلول‌های بنفش و هم صورتی دیده شد، چند حالت ممکن است: نمونه مخلوط باشد، رنگ‌بری ناقص یا بیش از اندازه انجام شده باشد، یا کشت پیر باشد. در این شرایط با یک کشت جوان (۱۸ تا ۲۴ ساعته) و شاهد گرم مثبت و گرم منفی دوباره رنگ‌آمیزی کنید.
برای ثبت نتیجه، شکل سلول (کوکسی، باسیل، کوکوباسیل، منحنی)، آرایش (تکی، زنجیره‌ای، خوشه‌ای) و رنگ را یادداشت کنید. این اطلاعات کنار نتیجهٔ کشت و آزمون‌های بیوشیمیایی، برای تصمیم‌گیری دربارهٔ نوع باکتری و درمان یا بهداشت لازم است.
در مجموع، رنگ‌آمیزی گرم را باید بخشی از یک مسیر بدانید: نمونه‌گیری استریل، کشت روی محیط مناسب، رنگ‌آمیزی، آزمون‌های بیوشیمیایی و در صورت نیاز تأیید مولکولی. اگر هر مرحله ثبت شود، در صورت بروز مشکل می‌توانید علت را سریع پیدا کنید و نتیجهٔ آزمایشگاه به تصمیم‌های مدیریتی مزرعه قابل اتکا می‌شود.
جمع‌بندی دربارهٔ رنگ آمیزی گرم
در جمع‌بندی، موضوع «رنگ آمیزی گرم» را باید بخشی از برنامهٔ ثابت کار خود بدانید. هرچه دربارهٔ «رنگ آمیزی گرم» زودتر و منظم‌تر اقدام کنید، هزینهٔ اصلاح‌های بعدی کمتر می‌شود. اگر دربارهٔ «رنگ آمیزی گرم» پرسشی دارید، تیم مشاورهٔ دانش ثمین پردیس رضوان در کنار شماست.
سؤالات متداول
چرا رنگ‌آمیزی گرم همچنان استفاده می‌شود؟
چون ارزان، سریع و راهنمای مهم انتخاب محیط کشت و آزمون‌های بعدی است.
ویبریوها چه رنگی می‌گیرند؟
معمولاً گرم منفی و میله‌ای خمیده یا کاما شکل دیده می‌شوند.
مطالب مرتبط: تعیین بار میکروبی. مرجع: Gram stain.
مشاورهٔ آزمایشگاهی و آموزشی
برای راه‌اندازی آزمایشگاه کیفیت آب، آموزش کارآموزان یا انتخاب کیت و تجهیزات، از فرم درخواست مشاوره دانش ثمین پردیس رضوان استفاده کنید.
